PEAR 技术

PLoS ONE:新技术酶法大规模制造高纯度硫代修饰寡核苷酸分子

本项目已具备市场投资价值,现面向国际和国内进行招商引资,欢迎投资洽谈

以下生物技术网站进行了报道:

http://www.bio1000.com/plus/view.php?aid=439682  http://news.10jqka.com.cn/field/20130708/535999147.shtml  http://www.bioon.com/biology/bioenginering/575693.shtml   http://www.bio360.net/news/show/5999.html http://www.biotech.org.cn/information/109464  http://www.zsr.cc/PostdoctorHome/Innovation/201307/796787.html

详细资料(英文)

2013年7月4日,PLoS ONE最新报道了一种能制造高纯度硫代修饰寡核苷酸分子的新方法,可用于解决目前寡核苷酸制造方法相关的问题。这项技术由中国海洋大学生命科学学院的研究人员完成,这一研究成果将有助于寡核苷酸药物的发展。

寡核苷酸一般采用化学方法合成,但化学合成寡核苷酸会出现错误,纯度较低,而纯化十分困难。而且,大规模合成寡核苷酸的成本十分高昂,大大限制了寡核苷酸药物的研究和应用。文章的通讯作者,中国海洋大学的汪小龙副教授解释道:“我们首创了一种新的基于热循环的寡核苷酸扩增方法,称为“聚合酶-内切酶扩增反应”(Polymerase-endonuclease amplification reaction, PEAR),该方法采用酶催化法使寡核苷酸分子数目指数增加,实现寡核苷酸的自我复制,大大提高寡核苷酸产品的纯度。”

该论文的另一作者陈刚博士说:“这种新的寡核苷酸生产方法具有很多优点,能解决目前寡核苷酸制造中的诸多问题。PEAR产物无需经过任何处理,无需加入新的引物和模板,直接作为‘种子’进行二次扩增,使寡核苷酸等小分子核酸能够像病毒一样自我复制。该反应采用热循环仪生产寡核苷酸,设备成本低,很容易放大至克级、公斤级,能够生产大量修饰寡核苷酸。”

PEAR反应独特的“滑动-切割反应机理”,由耐热DNA聚合酶和耐热限制性内切酶协同作用,使得只有目标序列寡核苷酸能够指数扩增,而非目标序列由于缺少重复序列和酶切位点,无法被扩增。目前已成功用PEAR方法制备出了带有硫代、氟代和甲基修饰基团的寡核苷酸,经变性高效液相色谱和电喷雾质谱检测(LC/MS),证实其分子结构和序列无误。与化学合成法相比,PEAR产物几乎没有错误序列,因此PEAR产物纯度极高,纯度接近100.0%。

该研究由国家自然科学基金项目“聚合酶-内切酶扩增反应制备反义寡核苷酸(81072567)”资助。该课题评审和立项专家意见认为:“PEAR技术在大规模制备寡核苷酸药物中具有良好的应用前景”。目前该方法已经申请国际发明专利(PCT/CN2009/000362),将使我国拥有自主知识产权的核酸扩增技术,并很有可能用于生产成分更纯的寡核苷酸类基因药物。

最近,我们克隆表达了耐热DNA聚合酶,RNA聚合酶和耐热核酸内切酶,使PEAR反应成本大幅度下降;并且设计制造了触控可编程大容量热循环核酸扩增仪,使单个PEAR反应的产量达到0.136mg,可制备克级寡核苷酸,使PEAR技术真正可进行大量制备寡核苷酸类基因药物。

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相关背景:寡核苷酸是生命科学等领域研究的一种基本工具,近期生物医药研究和发展中取得了一些重大突破,寡核苷酸药物市场前景十分看好。反义寡核苷酸已经被开发为基因靶向治疗的药物,用于抗病毒、抗肿瘤和治疗遗传性疾病。CpG寡核苷酸则能够激活非特异性免疫反应,可用作免疫增强剂和疫苗佐剂。2013年1月,美国ISIS公司和Genzyme公司合作的一大成果反义寡核苷酸药物KYNAMRO™(Mipomersen)通过美国FDA认证,目前已经上市。Mipomersen是化学合成的辅助降脂药物,通过反义寡核苷酸抑制载脂蛋白 B-100的mRNA,用于治疗家族性高胆固醇血症 (HoFH)。

现代分子生物学实验室中,普遍用寡核苷酸作为引物,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增核酸分子,但PCR不能直接扩增寡核苷酸。因为它们往往只有18-30个核苷酸的长度,无法设计一对特异性PCR引物。用PCR来扩增寡核苷酸,必须首先设法(如加接头或使用通用引物)将目标延长。另外,PCR只是将寡核苷酸引物延伸,PCR扩增产物DNA的分子数不可避免地受输入寡核苷酸引物浓度的限制,二次扩增必须加入新的寡核苷酸引物,因此PCR技术不适合于大规模制备寡核苷酸。

目前国际上已经出现了一些新型核酸扩增方法,但能够用于扩增寡核苷酸的方法极少。2003年PNAS杂志报道了指数扩增反应(EXPAR)。2013年6月2日Nature Methods杂志报道利用滚环复制或者细菌体内复制DNA序列的过程,能以较低的成本、按特定比例制造大量的DNA分子。但这些方法目前尚不能产生带有修饰基团的寡核苷酸,也没有实现大量制备。由于天然的寡核苷酸在体内会在几分钟内被很快降解,而且具有一些毒副作用,因此作为药物的寡核苷酸必须在磷酸二酯键中带有硫代修饰基团,增强寡核苷酸在体内的稳定性。